三、茎尖的培养方法
在进行脱毒培养时,由于微小的茎尖组织很难靠肉眼操作,因而需要一台带有适当光源的简单解剖镜(8-40倍)。除了在进行植物组织无菌培养一般工具外,还需要一套解剖刀。剥离茎尖时,应尽快接种,茎尖暴露的时间应当越短越好,以防茎尖变干。可在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行操作,有助于防止茎尖变干。
不过和其他器官的培养一样,在进行茎尖培养时,首要是获得表面不带病原菌的外植体。因此,一般来说,茎尖分生组织由于有彼此重叠的叶原基的严密保护,只要仔细解剖,无须表面消毒就可以得到无菌的外植体。有时消毒处理还会增加培养物的污染率,所以选取茎尖前,可把供试植株种在无菌的盆土中,放在温室中进行栽培。浇水时要直接浇在土壤中而不要浇在叶片上。另外,最好还要给植株定期喷施内吸杀菌剂,可用多菌灵0.55和抗生素(如0.1%链霉素)。对于某些田间种植的材料,可以切取插条出入Knop溶液中令其长大,由这些插条的腋芽长成的枝条,要比由田间植株上直接取来的枝条污染小的多。
为了保险起见,在切取外植体之前一般仍须对茎芽进行表面消毒。叶片包被严紧的芽,如菊花、兰花,只须75%酒精中浸蘸一下,而叶片包被松散的芽,如香石竹、蒜和马铃薯等,则要用0.1%次氯酸钠表面消毒10分钟。对于这些消毒方法,在工作中应灵活运用,如在大蒜茎尖培养时,可将小鳞茎在75%酒精中浸蘸一下,再用灯火烧掉酒精,然后解剖出无菌茎芽。
在剥取茎尖时,把茎芽置于解剖镜下,一只手用镊子将其按住,另一只手用解剖针将叶片和叶原基剥掉,解剖针要常常蘸入90%酒精,并用火焰灼烧以进行消毒。但要注意解剖针的冷却,可蘸入无菌水进行冷却。当一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后,用解剖刀片将分生组织切下来,为了提高成活率,可带1-2枚幼叶,然后将其接到培养基上。接种时确保微茎尖不与其他物体接触,只用解剖针接种即可。
将接种好的茎尖置于22℃左右的温度下。每天以16小时 2000-3000lx的光照条件下培养。由于在低温和短日照下,茎尖有可能进入休眠;所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。微茎尖需数月才能成功。
茎尖培养的继代培养和生根培养和一般器官的培养相同,这里不再叙述。
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